体视显微镜样品制备五步法：从固定到成像的全流程解析

作为宏观观察利器，体视显微镜以立体成像、大景深、宽视野著称，广泛应用于质检、生物解剖、工业检测等领域。其样品制备虽不如电子显微镜复杂，但仍有五大关键步骤直接影响成像效果。本文基于Leica、Olympus等设备使用规范，系统梳理从样品固定到三维合成的全流程。

一、样品固定：稳定性与可视化的平衡术

固定方式选择

微型样品：导电胶粘贴法（银胶/碳胶）

脆弱样品：琼脂糖包埋法（1%浓度凝胶）

三维样品：昆虫针定位+蜡封固定

避免使用油性胶水（易反光）

固定角度优化

昆虫标本：腹面朝上+45°倾斜

电子元件：引脚朝上+标签标注

植物组织：切面朝上+甘油保湿

二、摆放定位：空间层次感的营造

景深控制技巧

多层样品：阶梯式摆放（每层间隔>5mm）

高矮样品：泡沫块垫高法

景深计算公式：DOF=2λ/(NA)²（λ=波长，NA=数值孔径）

背景处理

反光样品：消光漆喷涂（哑光黑）

透明样品：衬背染色（亚甲基蓝溶液）

吸光样品：环形LED补光

三、照明优化：光影魔术的**调控

光源选择矩阵

光路调节

暗场观察：关闭透射光+侧光45°入射

偏振光：添加偏振片消除反光

漫反射光：磨砂玻璃滤光片

四、图像处理：从二维到三维的跃升

景深扩展技术

焦点堆叠法：拍摄15-20张不同焦面照片

软件推荐：Helicon Focus（自动融合）

参数设置：重叠率70%+步进1μm

三维合成

多角度拍摄：每30°拍摄一张（共12张）

软件处理：Agisoft Metashape生成点云

输出格式：OBJ/STL/PLY通用格式

五、特殊样品处理技巧

液体样品

密封舱法：使用透明比色皿

悬浮颗粒：添加甘油增加黏度

避免气泡：真空泵脱气处理

温度敏感样品

低温台：液氮冷却至-196℃

加热台：PID温控±0.5℃

相变观察：缓慢升温（0.5℃/min）

常见失败案例警示

案例1：未固定昆虫翅膀导致观察时移动
改进方案：昆虫针+软蜡固定

案例2：金属部件反光严重
优化策略：环形偏振光+消光漆处理

案例3：景深不足导致部分结构模糊
解决方案：焦点堆叠+后期融合

结语：让宏观世界跃然屏上

体视显微镜的样品制备是"微观雕塑"与"光学魔术"的结合。建议建立标准化制备流程，记录关键参数（如光源角度、固定方式）。