生命科学显微镜的光学性能

显微镜的光学性能由下列八个基本光学参数（或参量）来决定:

（一）数值孔径 
数值孔径又叫镜口率。它是指所观察的物体与镜头间介质的折射率n与物镜镜口角α一半的正弦值的乘积。用N.A或A.来表示。即：　N.A.＝nsin（α/2）
所谓镜口角是指被观察点射入物镜前透镜的边缘光线之间的夹角。
即图10-1-2中的角α。                                          

数值孔径是物镜与聚光镜的重要参数，与显微镜的其它各个光学参数都有密切关系。一般希望它越大越好。从公式中可知：提高数值孔径有两种方法，一是增大镜口角，二是增大物镜与标本之间的折射率。
采取前一种方法时，可以让标本与物体尽量靠近。但无论怎样靠近，α总是小于180°。这样，sin（α/2）也小于１。而空气的折射率n＝1。因此，干燥系物镜的数值孔径nsin（α/2）总是小于1，一般在0.04～0.95之间。
采取后一种方法时，可在物镜与标本之间加入折射率较大的介质。如香柏油的折射率n＝1.515，使用香柏油为介质时，可使数值孔径达到1.2以上。这就是为什么在有些情况下要使用油镜的原因。目前油镜所能达到的更大数值孔径为1.4。

（二）分辨率 
分辨率又叫鉴别率或分辨本领。所谓分辨率是指显微镜分辨被检物体细微结构的能力。它与分辨距离成反比。分辨距离是指能被分辨开的两物点间的更小距离。分辨距离越小，显微镜的分辨率越高。如果两物点间的距离小于分辨距离，就会把两点误看成一点，无法看清其结构。显微镜的分辨率是由物镜决定的。目镜只起放大作用，不能增加显微镜的分辨率。
在普通中心照明的情况下，物镜的分辨距离ｄ由下式决定。
　ｄ＝（λ/2）N.A.　
式中：ｄ表示分辨距离, 单位是微米，λ表示照明光线的波长，单位也是微米。
在可见光中，亮度更大而且对人眼更敏感的波长为0.55μm，物镜更大的N. A.为1.4。代入上式可得ｄ近似为0.2μm。即，使用普通光学显微镜，在中心照明的情况下，分辨距离的尤限为0.2μm。也就是说，小于0.2μm的两物体，普通光学显微镜无法区分。
使用紫外线，可以减小照明光线的波长，能使分辨距离达到0.1μm。但因紫外线不能为人眼所见。只能拍成照片后再观察。
电子流的波长只有0.00387nm。利用“电子透镜”或磁透镜来控制电子流，所制成的电子显微镜的分辨距离达零点几nm。可以用它去观察原子的结构。

（三）放大率
显微镜的放大率等于物镜的放大率和目镜的放大率的乘积。从原理上讲，放大率可以做的非常大。但是，如果标本的细节不能被物镜分辨开来，放大的再大，也毫无意义。理论上可以推导出来，显微镜更合适的放大率（称为有效放大率，用Ｍ有效表示）是在物镜的数值孔径的500～1000倍之间。即500N.A.≤Ｍ有效≤1000N.A.
在有效放大率范围内，眼睛可以长时间观察而不易疲劳。如果放大率低于500 N.A.，观察起来就很吃力。如果高于1000N.A.，则会使像质变坏，甚至造成不真实的像。因此，超过1000N.A.的放大率称为无效放大率。

（四）工作距离 
工作距离是指显微镜调焦后，在使用标准盖玻片和标准机械筒长的情况下，物镜的下表面至盖玻片上表面之间的距离。物镜的放大率越高，工作距离越短。一般10倍以下的低倍物镜，工作距离为5～7mm，而100倍的油镜，其工作距离只有0.19mm左右。

（五）焦点深度
当显微镜调焦于标本中某一平面后，不仅这一物平面可以看清楚，而且和它相连的上下两个物平面也能同时看清楚。这上下两个物平面之间的距离叫做焦点深度，简称焦深。
显微镜的焦深是很小的，而且数值孔径越大、总放大率越大，焦深越小。例如，使用N.A.为1.25/100倍的油镜、12.5倍的目镜观察时，焦深只有0.27μm。这就是说，调焦后一次只看清楚0.27μm厚的一个薄层。而普通标本一般都有几个微米厚。要想看完整个标本，需要使用显微镜的微调机构，自上而下分层观察。

（六）清晰度
显微镜成像的清晰度取决于其光学系统，尤其是物镜的光学性能。它与显微镜的设计、制造、使用和保管都有关系。是一个很重要而又很复杂的问题。从使用和保管的角度来说，影响清晰度的主要原因有：所使用的盖玻片的厚度不合格、调焦没有调到理想位置、总放大率用得过大、油镜的镜头没有擦干净、镜片生霉等。

（七）镜像亮度
镜像亮度是指显微镜中所看到的物像的亮暗程度。为了便于观察，我们希望所成的像亮一些。在外部光线不变的情况下，镜像亮度与数值孔径的平方成正比，而与总放大率的平方成反比。要想使镜像亮度大些，应使用大数值孔径的物镜，配以低放大率的目镜。例如，在物镜相同的情况下，使用5倍的目镜与使用10倍的目镜相比，其镜像亮度要大4倍。
使用电光源的显微镜，其镜像亮度可以通过调节照明灯的亮度来控制。

（八）视场

视场又叫视野。是指显微镜一次能够看到的被检物体的范围。通常我们希望视场尽可能大些。显微镜的视场由物镜的视场和目镜的视场共同决定的。普通物镜的视场小于20mm，大的可达40mm以上。普通10倍目镜的视场为14mm，大的可达24mm以上。物镜与目镜一旦设计好后，其视场便固定了。因一般显微镜的视场较小，不可能在一个视场内看到整个标本，只能看到标本上尤小的一个小圆块。而且视场的大小与显微镜的总放大率成反比。总放大率越大，视场越小。解决的办法是利用移动器，使标本的各部分依次进入视场，轮流观察。
  上述八个参数之间是互相联系、互相制约的。例如，使用数值孔径大的物镜，其分辨率、放大率、镜像亮度都大，对观察有利。但它的工作距离短、焦点深度和视场小，使用起来不太方便。在使用中应根据具体使用情况，照顾重点，兼顾其他。使用显微镜的根本目的是要看清楚样本的细节，否则，就失去了使用显微镜的意义。从这个前提条件看来，分辨率应摆在首位，放大率摆在第二位。其余各参数应列入从属地位。因为前两个参数是决定被检物体能否看得见的问题。其余各参数只是决定使用方便不方便或观察效果好不好的问题。因此，使用时，应在保证主要参数满足要求的前提下，适当兼顾其余各参数。